五种致泻性大肠埃希氏菌鉴定试剂盒（PCR法）

产品说明

病菌检测系列可针对食品、饲料等样品中的致病微生物的特异核酸片段进行扩增，仪器实时监测扩增过程中的荧光信号变化，自动判读结果。本产品用于致-泻大肠埃希氏菌的检测。检出限为10^3 CFU/ml。
产品组成（96 测试）

所需仪器
ABI ，BioRad，TaKaRa等 PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪等电泳配套设备。（使用荧光定量 PCR仪进行定性判读时则无需电泳设备）自备耗材和仪器
①灭菌 1.5mL或 2.0mL离心管 ；②冰盒 ；③移液器 （0.5-10μL，10-100μL，100-1000μL）及配套灭菌吸头 ；④ 离心机； ⑤涡旋混匀器； ⑥金属浴。
◆ 样品处理
参照 《GB4789.6—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 致-泻大肠埃希氏菌检验 》中的操作步骤进行前增菌。建议使用试剂配套细菌基因组 DNA提取系列产品。
◆ 实验操作
1．试剂配制 （试剂配制 区，放置于冰盒中进行）取出各管试剂 ，将试剂完全解冻 ，离心 30s。取 12×(所待检样品数 +3)的 PCR反应管 ，按 12个一组排列 并编 号，依次 向各管中 加入 23μL 的 12种反应液 。
2.添加模板（样本制备区，放置于冰盒中进行）向每管反应液中分别加入2μL模板 （或直接使用无菌吸头挑取少许待检菌落至反应管中 ）。
加样示例：（有N个待测样品）取(N+3)组 12个一组 的反应管 ，按顺序 组 12管中 全部加 入 2μL的 NG-DW， 组 12管中 全部加 入 2μL
的 NG-Ecoli，第三 组 12管中 全部加 入 2μL的样品 1模板 ，第四 组 12管中 全部加 入 2μL的样品 2模板 ，…， 组 12管中 全部加 入 2μL的 PG-Ecoli。盖好 PCR管盖后，涡旋混匀 30s，离心 1min，立即进行 PCR扩增反应。
3.扩增反应（扩增及产物分析区）
按下列条件设置扩增反应：

4. 产物电泳（扩增及产物分析区）
称量 4. 0g 琼脂糖粉，加入至200 mL 的1×TAE 电泳缓冲液中，充分混匀。使用微波炉反复加热至沸腾，直到琼脂糖粉完全融化形成清亮透明的溶液。待琼脂糖溶液冷却至60℃右时，加入溴化乙锭( EB )至终浓度为0.5μg/mL，充分混匀后，轻轻倒入已放置好梳子的模具中，凝胶长度要大于 10cm，厚度宜为 3mm~5mm。检查梳齿下或梳齿间有无气泡，用一次性吸头小心排掉琼脂糖凝胶中的气泡。当琼脂糖凝胶完全凝结硬化后,轻轻拔出梳子，小心将胶块和胶床放入电泳槽中，样品孔放置在阴 。向电泳槽中加入 1×TAE 电泳缓冲液，液面高于胶面 1mm~2mm。将 5μL PCR 产物与1μL 6×上样缓冲液混匀后，用微量移液器吸取混合液垂直伸入液面下胶孔，小心上样于孔中；阳性对照的  PCR  反应产物加入到 一个泳道; 个泳道中加入 2 μ L 分子量 Marker  。接通电泳仪电源，根据公式：电压=电泳槽正负极间的距离（cm）×5V/cm 计算并设定电泳仪电压数值；启动电压开关，电泳开始以正负极铂金丝出现气泡为准。电泳 30min~45min 后，切断电源。取出凝胶放入凝胶成像仪中观察结果，拍照并记录数据。

可使用 Gold view、Gal-Rad 等等效的核酸荧光染料替代 EB。
推荐使用 DNA Marker：DL2000 或 100bp ladder，等可指示 100bp~1500bp 条带的 Marker。
◆ 结果分析
1. 阴阳性判读：
进行电泳检测时，需对比 Marker 进行判断，当目的靶标对应位置出现单一显著条带时可判断该靶标为阳性；
否则为该靶标检测为阴性。

示例电泳图

2. 有效性判读：
需同时满足：1.空白对照中所有泳道均为阴性；2.阴性对照中 uidA 泳道阳性，其余泳道阴性；2.阳性对照中所有泳道阳性，此时可判断实验有效。如无法满足上述条件，则实验无效，需重复实验；如重复后结果仍为无效，请于本公司技术支持联系。

3. 结果判读：

在实验有效的情况下，可根据下表进行判读：

97%以上大肠埃希氏菌为 uidA 阳性，可参考阴性对照中该基因检测结果判断扩增效果；
当结果判定为EPEC 阳性时，若 bfpB 靶标为阳性则说明样品含有典型EPEC；若 bfpB 靶标为阴性则说明样品为非典型EPEC；
当结果判定为STEC/EHEC 阳性时，若eae 靶标为阳性则说明样品含有典型EHEC；若 eae 靶标为阴性则说明样品为非典型EHEC。

企业信息
上海晅科生物科技有限公司