非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（预混）

【名称】

通用名：非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒

汉语拼音：Feizhou zhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe

英文名称：African Swine Fever Virus Real-time PCR Detection Kit

【主要成分与含量】

【作用与用途】 用于血液、组织、血粉、饲料、环境拭子等样品中的非洲猪-瘟病毒的科研检测。

【用法与判定】

1 样品处理

1.1 血液样品：用EDTA抗凝采血管采集血液，充分混匀，编号。

1.2 组织样品：用无菌剪刀和镊子剪取病死或剖杀猪主要脏器（淋巴结、*、扁桃体）约2g，加入10ml PBS或生理盐水，于研钵或组织匀浆器中充分研磨后转入1.5 mL离心管中编号备用。

1.3 血粉样品：取血粉约2g，加入10ml PBS或生理盐水混合均匀，编号备用。

1.4 饲料、环境拭子等样品：参照专用的商品化提取试剂盒的说明书操作。

2 操作步骤

2.1 病毒DNA的提取

2.1.1 待检样品份数总和用n表示 ，取n个灭菌的1.5ml离心管，逐管编号。

2.1.2 每管加入样本处理液A 30μl。

2.1.3 每管分别加入已处理的待检样品3μl，充分混匀，室温（18-25℃）处理5分钟，旋涡震荡30秒。

2.1.4 每管加入样本处理液B 30μl，震荡混匀，待检。

2.1.5 处理后的样本如在2小时内进行下一步试验，请于4℃保存，如不能立即进行下一步试验，请于-20℃保存。

备注：饲料、环境拭子等其它样品，此步骤同样参照专用的商品化提取试剂盒的说明进行操作。

2.2  PCR试剂分装（在试剂准备区进行）及加样（在样品处理区进行）

2.2.1 将PCR混合反应液复溶，旋涡震荡混匀后瞬时离心后备用。

2.2.2 将PCR混合反应液按20μl/管分装至PCR反应管中（分装数量：n待测样本数+1阳性对照+1阴性对照），并移至样品处理区。

2.2.3 用带滤芯的吸嘴分别取已处理好的样品、阴性对照、阳性对照各5μl分别加到装有PCR混合反应液的反应管中，盖紧管盖，漩涡混匀，瞬时离心，移至扩增检测区。

2.3 PCR扩增检测（在扩增检测区进行）

2.3.1 将PCR管放入PCR仪。

2.3.2 循环参数设定（根据实际情况选择循环参数）

2.3.2.1 常规循环参数：

2.3.2.2 快速循环参数

2.4 仪器检测通道选择：荧光信号选择FAM 通道。参比荧光NONE,请勿选ROX。

3 结果成立条件

阳性对照：CT值＜32并有明显的扩增曲线。

阴性对照：无CT值或者CT值>38，线性为直线或者轻微斜线。以上要求需同时满足，否则本次实验无效，需要重新进行。

4 结果判定

非洲猪-瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（预混）【注意事项】

1.所有实验过程应遵守农业农村部关于非洲猪-瘟病毒检测相关的规定。

2.反应体系应在特定配液区中配制，整个实验过程严格控制污染。

3.PCR整个试验分试剂准备区、样品处理区、扩增检测区。流程顺序为试剂准备区→样品处理区→扩增区。严禁器材和试剂倒流。

4.反复冻融试剂将减低检测灵敏度，本试剂盒建议反复冻融不超过5次。

5.-20℃保存的各试剂管使用前应在室温下完全融化，液体融化后需 混匀，2000rpm离心15s，使用后立即放回-20℃。

6.在DNA提取过程中，避免核酸酶污染，尽量缩短操作时间。

7.注意防止试剂盒组分受污染。不要使用超过有效期限的试剂，不同批号之间的各组分不要混用。

8.PCR反应管避免气泡存在，管盖需盖紧。

非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（预混）【规格】25测试/盒

【贮存与有效期】-20℃避光保存12个月。